猪场的基本情况
 

　　河北某猪场，存栏1500头基础母猪，一点式流水线生产。25～28日龄断奶后，母猪下床，仔猪留在原床(产房、保育一体)，继续饲养到70日龄，然后进入生长育肥舍。
 

　　2012年底，该场暴发蓝耳病，造成母猪较严重的流产。然后，该场开始使用PRRSV弱毒自家苗(类CH-1a向HP-PRRSV过渡毒)免疫母猪和仔猪，母猪免疫3次/年，仔猪14日龄免疫1次。之后，母猪群逐步稳定，但每批40～50日龄保育仔猪呈规律性发病，表现为发热、咳嗽、腹式呼吸、被毛粗乱，发病率达100%，死亡率可达25%～45%。
 

　　2014年7月份以后，猪场开始选用“瑞兰安”于14日龄、42日龄各免疫一次仔猪，每次1头份(开始1个月每次0.5头份，之后每次1头份)，其它原有的管理方式和加药程序保持不变。
 

　　2014年10月份，母猪开始普免“瑞兰安”，11月份加强免疫一次，以后每3个月免疫一次，直到2015年11月起调整为每4个月免疫一次。母猪各次准确的免疫时间如下：第一次，2014年10月26日;第二次，2014年11月28日;第三次，2015年2月26日;第四次，2015年5月29日;第五次，2015年8月28日;第六次，2015年11月26日。
 

　　该场在2014年12月至2015年1月、2015年5月至6月期间产房有两次腹泻流行过程(根据临床表现、眼观病变和病原检测结果诊断为猪流行性腹泻)。
 

　　使用“瑞兰安”免疫后生长猪PRRSV感染毒株的评估
 

　　2015年5月4日，采集保育猪组织病料10份，合样成5份进行RT-PCR检测，检测结果显示其中4份合样为PRRSV ORF7阳性，这4份阳性样本的编号分别为HeBLP01-1～HeBLP01-4，经ORF3、ORF5、Nsp2扩增后测序得到ORF3和ORF5各3个片段及4个Nsp2片段。
 

　　2016年1月8日，采集6周龄、8周龄保育猪各6份血样，每3份血样合成1个样(共4份合样)进行RT-PCR检测，检测结果显示其中3份合样为PRRSV ORF7阳性，这3份阳性样本编号分别为 HeBLP02-1～HeBLP02-3，经ORF3、ORF5、Nsp2扩增后测序得到ORF3和ORF5各3个片段，没有得到Nsp2片段。
 

　　利用DNAstar中的Meg Align对上述各基因片段和参考毒株的ORF3、ORF5、Nsp2基因进行序列比对和同源性分析，利用MEGA6.0中的邻接法对ORF3、ORF5、Nsp2基因进行遗传进化分析，得到依据这些基因推导编码的氨基酸序列的同源性及依据这些基因推导编码的氨基酸序列构建的进化树，见图1～图6。
 

　　图1 两次测序依据ORF3基因推导编码的氨基酸序列的同源性

　　图2 两次测序依据ORF3基因推导编码的氨基酸序列构建的进化树
 

　　由图1、图2可知，第一次检测到的3个样本HeBLP01-1、HeBLP01-2、HeBLP01-3的ORF3测序结果和第二次样本HeBLP02-1、HeBLP02-2、HeBLP02-3的ORF3测序结果非常相似，都属于类HP-PRRSV毒株，第二次样本测得的同源性和TJM株更近，都在99.2%以上。

　　图3 两次测序依据ORF5基因推导编码的氨基酸序列的同源性

　　图4 两次测序依据ORF5基因推导编码的氨基酸序列构建的进化树
 

　　由图3、图4可知，第一次检测到的3个样本HeBLP01-1、HeBLP01-2、HeBLP01-3的ORF5测序结果和第二次样本HeBLP02-1、HeBLP02-2、HeBLP02-3的ORF5测序结果差异较大。第一次测序的3个样本之间的ORF5基因同源性在99%以上，应该都来自于类HP-PRRSV毒株，而第二次测序的3个样本的ORF5基因是一样的，但和CH-1a、HB-1/3.9、JXA1毒株的氨基酸同源性分别为90.0%、92.5%、91.0%，应该来自于经典过渡毒。

　　图5 依据Nsp2高变区基因推导编码的氨基酸序列的同源性

　　图6 依据Nsp2高变区基因推导编码的氨基酸序列构建的进化树
 

　　由图5、图6可知，只有第一次检测的4个样本测到Nsp2基因，第二次检测的样本没有测到Nsp2基因，而且第一次检测到的4个样本的Nsp2目标基因片段和JXA1株的同源性在99.1%以上，应该都来自于HP-PRRSV毒株。
 

　　综合分析上述两次的ORF3、ORF5、Nsp2目标片段的基因测序结果可知，第一次检测到的野毒为HP-PRRSV，第二次检测到的野毒为经典过渡毒。另外，根据第二次没有测到HP-PRRSV的ORF5和Nsp2、测到的ORF3与TJM株的同源性高以及生长猪42日龄第二次免疫该疫苗的时间，可以知道第二次测到的ORF3应该来自TJM疫苗毒。
 

　　讨论
 

　　“瑞兰安”免疫后对HP-PRRSV感染能提供良好的临床保护效果，而对经典过渡毒株感染可能保护相对不完全。由该场病史和上文中的测序结果可知，一方面，长期以来该场保育猪出现的规律性发热、成活率低及临床不稳定主要是由HP-PRRSV感染引起的，以前的疫苗免疫后在一定程度上改善了保育猪的成活率，但没有解决群体性发热的问题。生长猪群免疫“瑞兰安”以后，保育猪不再出现群体发热的现象，生长猪成活率也明显改善且基本维持在较高水平(见上期文章中图4和图5)。另一方面，结合第二次测序和第三次的血清抗体检测结果及临床表现看，“瑞兰安”免疫后，没能阻止6周龄左右生长猪感染该经典过渡毒，保育猪临床上不同批次仍存在5～10%比例的被毛粗乱、发育不良猪可能和感染该毒株有关。
 

　　“瑞兰安”的有效免疫可减弱HP-PPRSV野毒的传播，影响生长猪群流行的PRRSV毒株的变化。“瑞兰安”免疫半年后的猪群流行毒株评估结果显示(第一次测序)，保育猪群存在的毒株为HP-PRRSV野毒，但该疫苗免疫再过8个月后的保育猪群流行毒株评估结果显示(第二次测序)，保育猪群存在的毒株为类经典过渡毒和TJM疫苗毒。这两次测序结果不同，可能是因为：
 

　　1)仔猪经过长时间有效免疫“瑞兰安”后，有效减弱了HP-PRRSV野毒在保育猪的复制和传播，HP-PRRSV的流行已经大幅度下降，而使得第二次测序没有测到HP-PRRSV。
 

　　2)仔猪经过长时间免疫“瑞兰安”后没能显著减少该经典过渡毒株的复制和传播，该毒株在保育阶段仍比较活跃。
 

　　3)两次采样的样本不同，第一次测序时采的样本为病死猪病料，第二次测序时，保育猪成活率较好且平稳，采的样本为保育猪疑似有病毒循环阶段的血样。另外，该场测到的经典过渡毒株极有可能来自于以前免疫的自家苗，这也提示我们，不管是什么方式(包括疫苗)，不要随意引进新的毒株进入一个猪群，一旦进入猪群以后，可能会长期存在。还有，评估猪群感染的PRRSV毒株，应从多个阶段采集不同性质的样本进行综合评估。
 

　　一些因素可能影响到“瑞兰安”对生长猪的免疫效果。
 

　　1)免疫期间发生PED，可能影响生长猪的免疫效果。由上期图4可知，该场仔猪免疫“瑞兰安”以后，保育猪的成活率一直很高，但是2015年2月、3月、6月、7月、8月的成活率相对较低，特别是在2015年7月，保育猪的成活率不到90%。通过流行病学调查知道，该场产房哺乳仔猪在2015年1月、5月、6月、7月出现严重的猪流行性腹泻，而保育成活率较低时期的仔猪在产房免疫PRRSV疫苗时多在发生腹泻期间或之后不久(14日龄免疫第一次)，都是在免疫“瑞兰安”期间经历了PED。近期有研究报道，猪感染PEDV以后，PEDV会抑制Ⅰ型干扰素的产生和随后的多种抗病毒蛋白的表达，从而在一定程度上降低了猪群的免疫力。
 

　　2)流行毒株影响生长猪的免疫效果。如前文所述，仔猪免疫“瑞兰安”后，保育猪群不再出现群发性发热，成活率一直稳定在较高水平，但是，临床上不同批次还有5%～10%的发育不良猪出现。结合文中的PRRSV测序结果知道，该场保育猪群除了存在HP-PRRSV以外，还存在经典过渡毒株，而该毒株和“瑞兰安”疫苗株的同源性才91%，该疫苗可能没有对此毒株感染提供好的保护(需要进一步的实验室研究证明)。
 

　　3)免疫程序可能影响生长猪的免疫效果。本场生长猪群一直实施14日龄和42日龄两次免疫的方式，没有根据PRRSV流行的时间调整免疫时间，而由上期内容3.中2015年6月18日和2016年1月8日的血清检测结果可知，该场这两段时间PRRSV循环较早，分别为4周龄和6周龄左右，所以该场这两个时间段的第二次免疫没有得到很好的临床效果。
 

　　生长猪群的生产成绩和PRRSV活跃时间、活跃毒株有关。
 

　　1)PRRSV野毒活跃时间越早，对其生产成绩影响越大。第一次血清检测结果显示，这段时间的免疫效果较好，尽管没有阻断PRRSV循环，但循环较晚，临床上保育猪的成活率较高，2014年9月～2015年1月的成活率都在98%以上(见上期文中图4)。第二次血清检测结果显示，这段时间的免疫效果较差(上文已分析，由于仔猪在免疫期间发生PED所致)，PRRSV野毒循环较早(4周龄左右)，保育猪的成活率较低，2015年6月、7月、8月都低于95%，2015年7月甚至不到90%(见上期文中图4)。
 

　　2)活跃的PRRSV毒株类型影响猪群的生产成绩。第一次测序的结果显示保育期活跃的野毒为HP-PRRSV，这段时间保育猪的成活率较差(见上期文中图4和本文2.部分)。第二次测序的结果显示保育期活跃的野毒为经典过渡毒，可能因为该毒株毒力不是很强，或该HP-PRRSV疫苗免疫后提供了部分保护，成活率较为稳定，只是不同批次出现一定比例的被毛粗乱、发育不良猪。
 

　　小结
 

　　由上文可知，通过对该场生长猪免疫“瑞兰安”前后生长猪的主要临床问题、保育猪和育肥猪的成活率，以及免疫后血清像和猪群中存在的PRRSV毒株的持续追踪，显示“瑞兰安”免疫后对HP-PRRSV感染表现出很好的临床保护效果：临床症状改善显著、保育阶段不再出现规律性的发热、保育期和育肥期的成活率显著提高、HP-PRRSV的复制及传播明显减弱。但是，在疫苗接种期间发生的PED、免疫程序不合理会影响该疫苗的临床效果，至于对其它同源性相差比较大的毒株的交叉保护是否有差异有待进一步的研究。