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　　引言

　　疫苗在控制世界范围内蓝耳病毒(PRRSV)方面起着非常重要的作用。灭活疫苗不能引起细胞免疫反应，然而，活疫苗具有潜在的返毒可能性，及与PRRSV野毒株或疫苗毒株发生基因重组的可能性。因此，预防PRRSV要求新型的疫苗既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫。PRRSV ORF5与GP6编码的蛋白GP5和GP6，具有很强免疫原性，刺激产生很好的中和抗体，对抗PRRSV的感染。近年来，致弱沙门氏菌能够很好地刺激细胞免疫反应，在构建工程疫苗作为活的载体。本研究中，构建致弱的沙门氏菌-蓝耳疫苗，评估其免疫原性。

　　材料与方法

　　克隆PRRSV WUH-3株的ORF5和ORF6基因(登录号：HM853673)，通过插入特定的基因序列来表达中和抗原从而修饰ORF5基因。然后，单个扩增产物，或融合到asd+表达质粒pYA3493中，然后电转到致弱的猪霍乱沙门氏菌中，从而获得重组的猪霍乱沙门氏菌表达靶基因，候选疫苗肌注小白鼠来评估。C501-GP5m免疫仔猪剂量为108.0CFU。测定中和抗体(NA)和细胞免疫反应。

　　结果

　　ORF5和ORF6基因经过大小和序列分析已经确定成功扩增。单个原始蛋白GP5、修饰后的蛋白GP5 GP5/M和表达蛋白的分子量分别为27kD、29kD和43kD，培养基上清中的重组猪霍乱沙门氏菌通过Western blot检测，并分别命名为C501-GP5、C501-GP5m和C501-GP5/M)，然而单个M蛋白没有表达。3种重组猪霍乱沙门氏菌与原始宿主工程菌的生长曲线一致。

　　用实验动物模型小白鼠免疫接种109.0CFU，所有检验的候选疫苗中，C501-GP5m产生最高的中和抗体滴度。在4周的淋巴细胞增生的反应区别不大，但是在这3组中，C501-GP5/M引起了强烈的反应。C501-GP5m引发最高水平的IFN-γ。

　　根据实验模式动物的结果，在仔猪中进一步评估C501-GP5m的免疫原性。C501YA-GP5m单独和在佐剂的刺激下产生的NA滴度分别为1:12.6和1:7.4。

　　结论与讨论

　　构建了3种重组的致弱沙门氏菌疫苗株。体外表达目的蛋白。在小鼠动物实验中，重组体能够引起NA和细胞免疫反应。C501-GP5m免疫的仔猪模型能够产生很好的NA滴度。总之，我们构建了一个新的候选疫苗。

　　当前，主要关注点是毒力返强的问题和PRRSV活苗突变的问题。ORF5编码GP5蛋白，是PRRSV的主要免疫原，但是中和表位的构象发生了改变，降低了其免疫原性。本研究中，抗原表位通过插入的片段有效地表达。最后通过动物实验显示这些重组体之中具有最好的免疫原性的一个。

　　蓝耳灭活苗和活苗的实际应用都会干扰流行病学诊断和PRRSV的调查，因为当使用ORF7蛋白免疫猪就会存在ORF7的抗体。然而，我们的新疫苗将不会干扰目前的抗体检测试剂盒，因为该重组体不表达ORF7蛋白。